離子交換劑由不溶性高分子基質(zhì)、荷電功能基團和與功能基團電性相反的反離子組成，在水溶液中，與功能基團帶相反電荷的離子 （包括緩沖液中的離子、蛋白質(zhì)形成的離子）依靠靜電引力能夠吸附在其表面。這樣，各種離子與離子交換劑結(jié)合時存在競爭關系。

無機離子與交換劑的結(jié)合能力與離子所帶電荷成正比，與該離子形成的水合離子半徑成反比。也就是說，離子的價態(tài)越高，結(jié)合力越強，價態(tài)相同時，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越強。在陽離子交換劑上，常見離子結(jié)合力強弱順序為：

在陰離子交換劑上，結(jié)合力強弱順序為：

對于蛋白質(zhì)這樣帶電荷的生物大分子，與離子交換劑的結(jié)合能力首先取決于溶液pH，它決定了蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，然后是蛋白質(zhì)的色譜相關區(qū)域，也就是電荷在蛋白質(zhì)表面的分布情況，這些在前面都已經(jīng)提到。此外，還取決于溶液中離子的種類和離子強度。溶液中的無機離子和蛋白質(zhì)競爭性的與交換劑結(jié)合，在起始條件下，溶液中離子強度較低，上樣后由于蛋白質(zhì)帶電荷數(shù)較多，與交換劑之間結(jié)合能力更強，因此能取代離子而吸附到交換劑上；在進行洗脫時，往往通過提高溶液的離子強度，增加了離子的競爭性結(jié)合能力，使得蛋白質(zhì)樣品從交換劑上解吸，這就是離子交換色譜的本質(zhì)。

pH和離子強度I是控制蛋白質(zhì)離子交換行為、分辨率、回收率等的重要因素。

pH決定了蛋白質(zhì)以及離子交換劑的帶電荷情況，因而是決定蛋白質(zhì)是否發(fā)生吸附的最重要參數(shù)。在進行分離時，應當控制pH使得蛋白質(zhì)和離子交換劑帶相反的電荷，這里涉及兩個方面。一方面，離子交換劑有一個工作pH范圍，在此范圍內(nèi)能夠確保離子交換劑帶充足的電荷。通常，陽離子交換劑應用時有一個pH下限，低于此pH會有很大一部分離子交換基團失去負電荷而不再能結(jié)合陽離子；而陰離子交換劑應用時有一個pH上限，高于此pH會有很大一部分離子交換基團失去正電荷而不能再結(jié)合陰離子。另一方面，溶液的pH直接決定了蛋白質(zhì)帶電荷的種類和數(shù)量，選擇適當?shù)膒H，能夠保證目的蛋白分子與離子交換劑帶相反電荷而被吸附，同時如果pH距離蛋白質(zhì)的等電點過遠，則造成蛋白質(zhì)與離子交換劑結(jié)合過于牢固而不易洗脫。

在選擇操作pH時還需特別注意目的蛋白的pH穩(wěn)定范圍，若超出此范圍會造成蛋白質(zhì)活性喪失，導致回收率下降。特別是由于陶南效應，離子交換劑表面pH與溶液pH是不一致的。在陽離子交換劑表面的微環(huán)境中，H⁺被陽離子交換基團吸引而OH-離子被排斥，造成交換劑表面pH比周圍緩沖液中低1個pH單位；而陰離子交換劑表面的微環(huán)境中，OH^-被陰離子交換基團吸引而H⁺離子被排斥，造成交換劑表面pH比周圍緩沖液中高1個pH單位。例如：某種蛋白質(zhì)在pH=5時被陽離子交換劑吸附，實際上該蛋白質(zhì)在交換劑表面是處在pH=4的環(huán)境中，若此蛋白質(zhì)在此pH條件下不穩(wěn)定就會失活。大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH=4以下穩(wěn)定性都會下降而使回收率降低。

由于溶液中的其他離子與蛋白質(zhì)競爭結(jié)合到離子交換劑上，因此離子種類和離子強度I是影響蛋白質(zhì)結(jié)合和洗脫的另一重要因素。在低的離子強度I條件下，蛋白質(zhì)通過荷電基團結(jié)合至離子交換劑上帶相反電荷的功能基團上；當競爭離子濃度即離子強度I逐漸升高時，蛋白質(zhì)逐漸被置換下來。對于帶有特定電荷數(shù)的蛋白質(zhì)，需要多高的鹽濃度才能將其從離子交換劑上洗脫下來，并沒有一個固定的規(guī)律，需要從實驗中摸索。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)在1mol/L的鹽濃度下能夠被洗脫，因此在探索條件階段，人們常把洗脫鹽的終濃度定為1mol/L。事實上在溶液中鹽類還常扮演穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的角色，為防止蛋白質(zhì)發(fā)生變性或沉淀，離子強度不宜太低。另外，離子的類型也是一個重要因素，不同離子從交換劑上將蛋白質(zhì)置換下來的能力是不同的，并且離子類型還對分辨率和不同蛋白質(zhì)的洗脫順序會產(chǎn)生影響。

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