?

我們的《液相色譜，你問我答》已經(jīng)發(fā)布三期了您困惑的問題，還有沒出現(xiàn)的嗎？如果有，那就快來看看這次有您想要的答案嗎~

Q1 我聽說有正相色譜和反相色譜，我想了解下什么是正相色譜？什么是反相色譜？它們有什么區(qū)別呢？

答：其實(shí)正相色譜和反相色譜是由流動相和固定相極性大小差異來分類的，通常正相色譜固定相極性比流動相極性大，常用的流動相有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等。而反相色譜剛好相反，是流動相極性比固定相極性極性大，常用的流動相有甲醇、乙腈、四氫呋喃、水等。反相色譜是目前Z通用的HPLC方法，大約95%的色譜工作者都在使用。

Q2 那我手上有一根色譜柱，我怎么知道是使用于反相色譜還是正相色譜呢？

答：目前來說，常用的反相填料有：C18、C8、C4 和苯基等；正相填料有：硅膠、氨基、氰基、二醇基等。

Q3 我通常看到有不同長度和內(nèi)徑的色譜柱，我能了解下色譜柱的長度和內(nèi)徑不同對我的色譜分析有什么影響呢？

答：對于色譜柱的長度和內(nèi)徑，我們可以基于我們需要分析的物質(zhì)的復(fù)雜程度來選擇，兩支同填料的色譜柱，柱長越短，分離時(shí)間越快，但柱越長分辨率將會更好，同時(shí)壓力也將更大，可結(jié)合樣品的復(fù)雜性和希望分離的時(shí)間來選擇合適的柱長。對于色譜柱的內(nèi)徑，窄徑柱可提高柱的靈敏度，并可明顯降低溶劑的使用量；寬徑柱可以將系統(tǒng)死體積的影響降到Z低，載樣量高，抗污染。下表可供我們選擇色譜柱時(shí)對柱內(nèi)徑的一個(gè)選擇。

Q4 那我想用不同內(nèi)徑和長度的柱子來進(jìn)行色譜方法轉(zhuǎn)移，我該怎么調(diào)整色譜條件呢？

答：對不同內(nèi)徑和長度的色譜柱，我們可以使用以下方法來轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量和流速：

Q5 我在看色譜柱的使用說明書中，通常都會提到柱體積，那我怎么計(jì)算我手上色譜柱的柱體積呢？

答：基本上色譜柱的柱體積計(jì)算公式都差不多，這里列舉月旭色譜柱柱體積計(jì)算：
以4.6mm×150mm的柱子為例：
柱管體積=πr2L=π×(0.23)2×15=2.49cm2=2.5ml
2.5ml×70%(沒有填裝的體積)=1.75ml=1個(gè)柱體積 

Q6 現(xiàn)在色譜填料的粒徑也有很多種，那我在色譜分析工作中，該怎么選擇色譜柱的中填料的粒徑呢？

答：目前市場上主要可供選擇的分析用填料粒徑主要有以下幾種：
1.7μm、1.8μm、 2.2μm-----快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀
3.0μm、3.5μm-----快速液相色譜柱：普通快速分析
5μm-----常規(guī)分析
其中5μm的粒徑是Z常用的，但是這里是指平均粒徑是5μm，也有可能有3μm和5μm粒徑的填料。
當(dāng)然色譜填料的粒徑越小，理論塔板高度越低，相應(yīng)的柱效越高，分離度和靈敏度就越好，而且在高線速度區(qū)域，柱效的降低也得于緩和；但是壓力會成倍上升。通常我們會結(jié)合色譜柱的長度來綜合選擇色譜柱的粒徑，下表可作為色譜柱填料粒徑選擇的一個(gè)參考。

Q7 那色譜填料的孔徑，我在測定什么樣的產(chǎn)品需要考慮呢？

答：現(xiàn)在多孔填料的 95%以上表面積在孔內(nèi)部，這樣只有分析目標(biāo)物進(jìn)入孔內(nèi)，才能達(dá)到分析分離的目的。而只有樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部。對于小分子的反相分離，選擇小孔徑（60? ~120?）填料柱，對于小分子和多肽，使用100? ~150?，而只有當(dāng)目標(biāo)物的分子量大于2000 時(shí)我們才會選擇300?孔徑的填料。 

Q8 那填料的比表面積對我的分析物之間有什么關(guān)系呢？

答：每克填料的比表面積與孔徑和粒徑有關(guān)，隨著孔徑的增加，比表面積降低。目前比表面積一般為：180m2/g-350m2/g，隨著比表面積增大，保留增加，載樣量增加，平衡時(shí)間增加（梯度洗脫尤為注意）。我們在日常色譜分析工作中可根據(jù)需要選擇合適的比表面積。

Q9 我在日常的色譜分析中，經(jīng)常看到色譜條件中提到色譜柱的封尾，什么色譜柱的封尾？為什么要封尾呢？

答：由于空間位阻的存在，鍵合反應(yīng)最多只能覆蓋 50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團(tuán)會發(fā)生離子交換作用，增加了保留，導(dǎo)致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三J基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，封端，封口。

Q10 封尾與不封尾的色譜填料有什么區(qū)別呢？

答：封尾消弱硅羥基作用；不封尾提高硅羥基影響，增強(qiáng)極性物質(zhì)的保留，降低柱流失，但是有些物質(zhì)會在不封尾的柱子上產(chǎn)生拖尾。