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分子排阻色譜探究竟

更新時間:2020-12-14 點擊次數:5140

分子排阻色譜有時又叫“尺寸排阻色譜”或“體積排阻色譜”,是根據待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。

分子排阻色譜法的分離原理為分子篩機制,色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經過修飾的凝膠,如葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等為填充劑,這些填充劑表面分布著不同孔徑尺寸的孔。分子進入色譜柱后,它們中的不同組分按其分子大小進入相應的孔內,大于所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部,在色譜過程中不被保留,早被流動相洗脫至柱外,表現為保留時間較短;小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑,在色譜柱中滯留時間較長,表現為保留時間較長;其余分子則按分子大小依次被洗脫,如下圖。

 

不同分子的物質的分子排阻洗脫示意圖

 

雖說分子排阻色譜的流動相和反相色譜的流動相很相似,但其分離機理卻是相差甚遠。下表為大家列出了兩種分離模式的異同:

 

 

那么分子排阻色譜在使用過程中究竟有哪些特別之處,今天就來一探究竟吧。

 

01 固定相

 

葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠聚合物基質的填充劑做固定相時,要千萬注意流動相和樣品中不可以出現任何有機溶劑,否則極易導致基質破碎。如《中國藥典》中規定的頭孢類聚合物的檢測方法:

 

 

 

《中國藥典》2020版頭孢類化合物聚合物測定

 

親水硅膠多為表面鍵合親水薄膜的高純硅膠,具有良好穩定性和批次重現性。如月旭科技Xtimate® SEC填充劑采用*的化學鍵合技術,在硅膠表面鍵合親水性聚合物以及親水性二醇基團(如下圖):

 

 

雙重鍵合機制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小,因而可廣泛應用于水溶性聚合物及生物大分子的分離和測定。

親水硅膠填料還有一個顯著特點,就是會有眾多孔徑選擇,以適合不同分子量大小的高分子化合物的分離。通常情況下,120Å、200Å和300Å的孔徑可適合大多數多肽、蛋白等高聚物的分子量分離,更大分子量的高聚物則要選擇更大孔徑的填料。

 

 

02 流動相

 

分子排阻色譜根據流動相的水溶性,分為凝膠過濾(GFC),凝膠滲透(GPC)。親水硅膠填充劑做固定相時,流動相多為上述水溶性溶劑,常稱作凝膠過濾(GFC或SEC)。而凝膠滲透的流動相多為脂溶性溶劑,如《中國藥典》22種有機氯的供試品前處理GPC步驟:

 

 

《中國藥典》2020版通則2341d一法22種有機氯類農藥殘留量測定法

 

03 方法開發

 

在使用月旭科技Xtimate SEC色譜柱進行分子量分布的方法開發中,有以下因素可能影響分離效果:

 

分子量

可根據目標物的分子量,來選擇合適孔徑的色譜柱。

 

樣品與流動相

為避免色譜柱堵塞,所有樣品和溶劑,包括緩沖鹽,都必須在使用前用0.45μm或0.22μm濾膜過濾。Xtimate SEC可以使用水或有機溶劑與水的混合物,與大多數緩沖鹽溶液也兼容。流動相使用前需脫氣,否則可能出現柱壓和基線波動較大。這時可用較大流速沖洗色譜柱2-5min,如對于7.8*300mm的色譜柱,可用1.25 mL/min的流速。

 

離子強度

色譜柱中不可避免會存在其他次級作用力,為了大限度降低填料與被測物的次級作用力,必須調整流動相的離子強度。NaCl是SEC分離中比較常用的鹽,可通過調整離子強度,減少次級作用力,進而改善峰形和分離效果。

 

pH

流動相的pH調整,更多也是為了減少色譜柱中的次級作用對被測物的影響,所以測定過程中需選擇合適的pH。為獲得z佳分離效果和延長使用壽命,建議使用pH在 2-7.5 范圍內的流動相。

 

流速

盡量采用低流速測試,可以提高分離度,進而獲得更好的測試效果。內徑為 4.6mm 和 7.8mm 的色譜柱,一般建議其正常操作流速分別為 0.1-0.4 和 0.1-1.25 mL/min。

 

柱長

通過增加色譜柱的長度可以改善SEC分離度,所以在分離過程中,在一根色譜柱達不到分離效果時,可以考慮兩根色譜柱串聯,甚至不同孔徑的色譜柱串聯(注:一般大孔徑的在前,小孔徑的在后)。這種條件下通常也會造成出峰時間延后,及系統壓力增加。

 

柱溫

z高操作溫度為 80℃。為了獲得長的使用時間,z佳操作溫度為 10-30℃。長時間在高溫(>80℃)下操作也會損壞色譜柱,這種情形在高的 pH(>7.5)條件下尤其突出。

 

后,在使用月旭科技Xtimate SEC色譜柱過程中,注意盡管Xtimate SEC可在高至2000psi 的壓力下使用,但正常的操作壓力應當低于1500 psi。長時間在高壓下運行會損壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來源于流速,因此大流速將受制于系統所能承受的壓力。一般而言,柱壓會隨著色譜柱使用時間的增加而逐漸增加。Xtimate SEC色譜柱日常使用完后沖洗,建議保存在高比例的水-有機溶劑中。

月旭科技多年專注于色譜柱的研發和生產,推出的色譜柱具有種類齊全、普適性強、峰形優異、超高柱效、批次穩定等特點。欲了解更多內容,歡迎聯系月旭科技當地銷售同事,我們將竭誠為您服務!

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