反相色譜柱一般是由硅膠，有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化硅膠或者聚合物作為基質(zhì)， C18作為鍵合相。典型反相色譜柱基于分析物與烷烴鏈之間的疏水相互作用，根據(jù)樣品組分的極性大小的差異而實(shí)現(xiàn)樣品組分的分離。該分離模式有賴于色譜柱多孔基質(zhì)內(nèi)的C18鍵合相的自由伸展構(gòu)象。

對(duì)于有機(jī)酸/堿類化合物，多羥基化合物以及偶氮類等極性化合物，由于含有羧基，氨基，羥基等可解離部分，其極性較大而不適合以經(jīng)典反相C18類鍵合相進(jìn)行分離。其典型表現(xiàn)為容量因子K過(guò)小，導(dǎo)致該類化合物在死時(shí)間附近出峰。

對(duì)于這些極性化合物，雖然我們可以在做梯度分析方法開發(fā)時(shí)，選擇降低起始有機(jī)相的比例，甚至以純水相作為起始流動(dòng)相來(lái)增大該類化合物的容量因子。但化合物色譜峰峰形會(huì)出現(xiàn)峰展寬以及嚴(yán)重的C18色譜柱固定相孔內(nèi)去濕現(xiàn)象（Dewetting）；在停泵并重新恢復(fù)流速后，會(huì)出現(xiàn)化合物保留時(shí)間減少，色譜峰峰形異常（峰分叉、峰拖尾）等方法重現(xiàn)性問(wèn)題，尤其以拖尾zui為常見。

對(duì)于這些極性化合物該如何得到較好的保留，在這里且聽小編慢慢道來(lái)。

一 孔內(nèi)去濕現(xiàn)象（Dewetting）

反相HPLC一般以水作為弱洗脫相，以甲醇、乙腈等有機(jī)試劑作為強(qiáng)洗脫相。在運(yùn)行梯度時(shí)，有機(jī)相的比例一般可在5%-100%范圍內(nèi)變化，以適應(yīng)不同樣品的分離需求。對(duì)于極性化合物來(lái)說(shuō)，在典型的C18色譜柱上，即使有機(jī)相比例為5%亦不能夠做到有效保留。在進(jìn)一步降低有機(jī)相比例（以至為零），就會(huì)引起色譜柱多孔內(nèi)表面以及固定鍵合相的去濕現(xiàn)象（Dewetting）。

如圖1A所示，5%及其以上有機(jī)相時(shí)，流動(dòng)相可輕易浸入固定相基質(zhì)多孔內(nèi)，浸濕內(nèi)表面以及C18烷烴鏈，且C18鏈呈自由伸展構(gòu)象，可很好的與樣品組分的疏水部分發(fā)生相互作用實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)谋Ａ簟．?dāng)使用100%水相的時(shí)候，如圖1B，雖然可以選擇增da色譜柱前段壓力的方式，使得純水相浸入基質(zhì)多孔內(nèi)部，卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)表面以及C18鏈的有效浸濕，此外由于色譜柱沿流動(dòng)相流動(dòng)方向上的壓力降現(xiàn)象（如圖2），使得整個(gè)色譜柱的浸濕狀態(tài)存在很大差異。當(dāng)柱前壓減小時(shí)（如停泵），由于多孔內(nèi)部的強(qiáng)疏水性，純水相則被“排出”孔隙，導(dǎo)致去濕現(xiàn)象發(fā)生，如圖1C所示

C18鏈在孔內(nèi)去濕現(xiàn)象發(fā)生前后，在多孔內(nèi)的構(gòu)象如下圖3所示。在典型反相HPLC流動(dòng)相下（水相≤95%），C18鏈在多孔內(nèi)呈現(xiàn)自由伸展構(gòu)象；在100%水相下， C18鏈則相互之間“交聯(lián)”并zui大程度的靠近內(nèi)表面，形成疏水屏蔽層，失去與待分離組分疏水部分相互作用的能力，導(dǎo)致保留時(shí)間變短。

二 極性化合物分離挑戰(zhàn)

以典型的反相C18色譜柱對(duì)極性化合物進(jìn)行分離時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間過(guò)短，色譜峰峰形拖尾問(wèn)題。保留時(shí)間過(guò)短往往是由于化合物本身或者在體系中解離之后極性過(guò)大，油-水分配系數(shù)過(guò)小而不能與疏水選擇性基團(tuán)發(fā)生足夠的疏水相互作用，進(jìn)而隨起始流動(dòng)相一起直接流出色譜柱。

如有機(jī)酸類化合物在流動(dòng)相pH大于其pKa時(shí)發(fā)生解離而本身帶負(fù)電，可與硅膠基質(zhì)上殘留的金屬離子發(fā)生靜電相互作用；有機(jī)堿類化合物在流動(dòng)相pH小于其pKa時(shí)發(fā)生解離而本身帶正電，與弱酸性的硅羥基產(chǎn)生靜電相互作用；多羥基，羥基-胺類有機(jī)化合物以及未解離有機(jī)酸堿類化合物與硅羥基之間的氫鍵相互作用。以上三種“二級(jí)保留”相互作用，均會(huì)造成有機(jī)極性化合物的拖尾。此外，溶解極性化合物的溶劑選擇不合適的話，也會(huì)導(dǎo)致色譜峰拖尾現(xiàn)象。典型極性化合物如下圖4所示。

因此，極性化合物在反相色譜柱上做分析方法開發(fā)時(shí)主要面臨以下幾方面的問(wèn)題：

（1）如何使得極性化合物具有適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間；

（2）如何避免在使用高水比例甚至純水相洗脫時(shí)出現(xiàn)的孔內(nèi)去濕（相塌陷）問(wèn)題；

（3）如何zui大可能地減小色譜峰拖尾因子，獲得優(yōu)異的峰形；

三 極性化合物分離策略

利用純水相洗脫方式對(duì)極性化合物進(jìn)行分離，面臨色譜柱固定相孔內(nèi)去濕（相塌陷）問(wèn)題，但可通過(guò)對(duì)經(jīng)典反相C18鍵合相進(jìn)行改性，或者使用其他鍵合相以及使用Hilic分離模式，zui大程度地減小或避免該現(xiàn)象的發(fā)生，同時(shí)做到對(duì)極性化合物有效保留。

色譜柱孔內(nèi)去濕現(xiàn)象的發(fā)生以及程度的大小與色譜填料顆粒孔徑的大小，多孔內(nèi)表面鍵合相的鍵合密度，所用烷烴鏈長(zhǎng)度、基質(zhì)表面裸露的硅羥基數(shù)量以及封端類型有關(guān)。

3.1 非封端短鏈烷烴鍵合固定相

這種類型的反相色譜柱主要特點(diǎn)有兩個(gè)：硅膠基質(zhì)表面裸露的硅羥基不封端以及鍵合固定相鏈長(zhǎng)度小于C8。由于固定相烷烴鏈長(zhǎng)度遠(yuǎn)小于C18，多孔內(nèi)疏水性變小，加之表面硅羥基不封端使得純水相與多孔接觸角變小，與典型C18相比，發(fā)生孔內(nèi)去濕現(xiàn)象的可能性大大減小。與此同時(shí)，該種類型的色譜柱由于鍵合烷烴鏈長(zhǎng)度較小，在對(duì)樣品組分分離的時(shí)候，吸附作用以及硅羥基氫鍵相互作用占主要地位。例如月旭Ultimate®XB-C1。

3.2 極性封端與極性增強(qiáng)型固定相

該型色譜柱采用極性或者親水性的封端試劑對(duì)表面裸露的硅羥基進(jìn)行封端，C18的鍵合密度較低，這種改性方式與典型的C18色譜柱相比，增大了內(nèi)表面的水浸潤(rùn)性且較低的鍵合密度也使得孔內(nèi)疏水性相對(duì)減小，因而允許使用100%水相。例如月旭Ultimate®ALK-C18。

3.3 極性內(nèi)嵌烷基固定相

這種類型的色譜柱在長(zhǎng)鏈烷基靠近硅膠內(nèi)表面的一端，內(nèi)嵌入甲酸酯基類、脲或者酰胺基以及硫酰胺基等極性改性官能團(tuán)。由于極性內(nèi)嵌，使得整個(gè)鍵合相的親水性增強(qiáng)，多孔內(nèi)疏水性減小，在100%水相條件下，極性內(nèi)嵌烷烴鏈依然保持自由伸展構(gòu)象。此外，內(nèi)嵌極性基團(tuán)對(duì)表面裸露的硅羥基亦有一定的屏蔽作用，減小了極性化合物特別是堿性化合物的拖尾因子，色譜峰峰形更加對(duì)稱。例如月旭Ultimate®Polar-RP。

四 常用耐100%水相色譜柱

月旭常用的耐100%水相的反相色譜柱有：

典型反相HPLC色譜柱在使用100%水相對(duì)極性化合物進(jìn)行分離分析時(shí)，易出現(xiàn)硅膠多孔內(nèi)去濕（相塌陷）現(xiàn)象，導(dǎo)致化合物保留時(shí)間減小，方法重現(xiàn)性出現(xiàn)問(wèn)題。通過(guò)對(duì)色譜柱硅膠表面或者烷烴鏈改性，如增加內(nèi)表面極性大小以及烷烴鏈內(nèi)嵌極性官能團(tuán)，使得多孔內(nèi)表面及固定相被水浸潤(rùn)能力增加，而減少或避免孔內(nèi)去濕現(xiàn)象的發(fā)生。此外，也可通過(guò)調(diào)整HPLC操作方式以及改變色譜條件，對(duì)極性化合物的保留因子以及峰形進(jìn)行調(diào)整。